01 ความเป็นมาและความท้าทายด้านการวิจัยและพัฒนา
1.1 ความเป็นมาการพัฒนายาของ MK-0616
Enlicitide Decanoate (หรือที่รู้จักในชื่อ MK-0616) เป็นตัวยับยั้ง PCSK9 เปปไทด์ชนิดรับประทานที่ได้รับการออกแบบโดย de novo เต็มรูปแบบ โดยมีจุดประสงค์เพื่อลดโคเลสเตอรอลไลโปโปรตีนชนิดความหนาแน่นต่ำ (LDL-C) และรักษาโรคหลอดเลือดหัวใจตีบตัน
ดังที่แสดงในรูปด้านบน นอกจาก MK-0616 แล้ว ตัวอย่างคลาสสิกในด้านนี้ยังรวมถึงยาปฏิชีวนะแวนโคมัยซิน (2) ยาเคมีบำบัดพาคลิทาเซล (3) และยาต้านมะเร็งเอริบูลิน (4) โครงสร้างที่ซับซ้อนของสารประกอบ 2 และ 3 หมายความว่าการสังเคราะห์จริงยังคงอาศัยวิธีการกึ่งสังเคราะห์โดยใช้ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ ในทางตรงกันข้าม ทีม Eisai ประสบความสำเร็จในการสังเคราะห์สารประกอบ 4 ทั้งหมดผ่านขั้นตอนมากกว่า 60 ขั้นตอน ซึ่งถือเป็นก้าวสำคัญในการสังเคราะห์สารประกอบโพลีคีไทด์
MK-0616 มีโครงสร้างทางเคมีที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัวมาก โดยเป็นโมเลกุลแรกที่ออกแบบตั้งแต่เริ่มต้นทั้งหมด (แทนที่จะได้มาจากแหล่งธรรมชาติ) นอกจากนี้ เนื่องจาก PCSK9 inhibitor แบบรับประทานในแต่ละวันมีจุดประสงค์เพื่อรักษาโรคหัวใจและหลอดเลือดมากกว่าการใช้งานด้านเนื้องอกวิทยาหรือการป้องกันการติดเชื้อ ความต้องการทั่วโลกของยานี้จึงเกินกว่าความต้องการยานวัตกรรมทั่วไปอย่างมาก โดยต้องมีการผลิตในระดับตั้งแต่หลายร้อยกิโลกรัมไปจนถึงหลายตัน
1.2 ความท้าทายและกลยุทธ์เชิงสังเคราะห์
ความซับซ้อนของโมเลกุลของ MK-0616 ทำให้เกิดข้อกำหนดที่เข้มงวดในการพัฒนากระบวนการ
ลักษณะโครงสร้าง: แม้ว่า MK-0616 มีต้นกำเนิดมาจากเปปไทด์แมโครไซคลิกที่ระบุผ่านการคัดกรองเทคโนโลยีการแสดงผล mRNA แต่ก็มีกรดอะมิโนที่ไม่ใช่แบบบัญญัติ 6 ตัว (รวมเป็นกรดอะมิโน 8 หน่วย) มาโครไซเคิลที่มีสมาชิก 37 ส่วน โซ่ด้านข้างเกลือแอมโมเนียม (10) และชิ้นส่วนที่ไม่ใช่เปปไทด์ (13) ซึ่งทำให้เทคนิคการสังเคราะห์เปปไทด์เฟสของแข็งแบบธรรมดาไม่ได้ผลอย่างสมบูรณ์ ดังที่แสดงด้านล่าง
ความท้าทายหลักที่ต้องแก้ไข
1、ความเสถียรของตัวกลางมีขั้ว (โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับชิ้นส่วนเกลือแอมโมเนียม ซึ่งต้องควบคุมการตอบโต้ตลอดกระบวนการทั้งหมด)；
2、ความสามารถในการเลือกของการปิดวงแหวนขนาดใหญ่ (ต้องมีการปรับลำดับการประกอบให้เหมาะสมระหว่าง 10 บล็อก)；
3、ความท้าทายในการขยายขนาด (หลีกเลี่ยงการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟี ตรวจสอบให้แน่ใจว่าปริมาณงานในระดับมิลลิกรัมต่อกิโลกรัม)；
ดังนั้น, การตัดสินใจสำคัญที่เสนอโดยนักวิจัยมีดังนี้：
1、แบ่งแยกและพิชิต：จัดลำดับความสำคัญของการสร้าง "ชิ้นส่วนทางเหนือ" (วงแหวน 17 อะตอมที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนที่ไม่เป็นที่ยอมรับที่ตำแหน่ง 5, 6 และ 7) และลดความซับซ้อนของกลยุทธ์การตัดแยกแมโครไซคลิกผ่านการวิเคราะห์การสังเคราะห์ย้อนยุค (เช่น โดยการเลือกพันธะเอไมด์ระหว่างตำแหน่ง 5 และ 8)
2、การแนะนำโซ่ด้านเทอร์มินัล：ชิ้นส่วนเกลือแอมโมเนียมมีขั้ว (10) จะต้องสงวนไว้สำหรับขั้นตอนการติดตั้งขั้นสุดท้ายเพื่อหลีกเลี่ยงความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับการทำให้บริสุทธิ์ขั้นกลาง
3、การประยุกต์ใช้กรดได้อย่างยืดหยุ่น–ปฏิกิริยาการวางตัวเป็นกลาง (RCM)：สายโซ่ที่เชื่อมโยงกับ n-hexane จะเกิดขึ้นที่ตำแหน่ง 7–13; ปฏิกิริยานี้มีความตั้งฉากที่ดีเยี่ยมและสามารถดำเนินการได้หลายขั้นตอน
ด้วยกลยุทธ์ชุดนี้ นักวิจัยได้สร้างเส้นทางสังเคราะห์ที่ปรับขนาดได้ในที่สุด ซึ่งปูทางไปสู่การประเมินทางคลินิก02
02 กลยุทธ์สังเคราะห์และการเพิ่มประสิทธิภาพ
จากการศึกษาเชิงวิเคราะห์ นักวิจัยได้ดำเนินการเพิ่มประสิทธิภาพหลายขั้นตอนหลายขั้นตอนของชิ้นส่วนแมคโครไซคลิกหลัก (ชิ้นส่วนภาคเหนือ) และเพิ่มประสิทธิภาพการประกอบชิ้นส่วนภาคใต้ด้วยผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย
2.1 การเพิ่มประสิทธิภาพหลายรุ่นของกลุ่มภาคเหนือ:
รุ่นแรก– 37 ครั้ง
การสังเคราะห์กรดอะมิโนที่ไม่เป็นที่ยอมรับ (เช่น 3-ไฮดรอกซีโพรลีน) มีประสิทธิภาพต่ำ เนื่องจากอาศัยปฏิกิริยาไซคลิกเซชันที่ไม่มีประสิทธิภาพ—เช่นการควบแน่นของ Dieckmann—เช่นเดียวกับความละเอียดของไครัล นอกจากนี้ กระบวนการนี้ต้องใช้การป้องกันการจัดการกลุ่มหลายรอบและการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีหลายครั้ง ดังแสดงในรูปด้านล่าง
ปัจจัยทั้งหมดเหล่านี้จำกัดการสังเคราะห์ชิ้นส่วนเป้าหมายในวงกว้าง
ระบบซิงโครนัสรุ่นที่สอง
ความก้าวหน้าเกิดขึ้นได้จากการเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพ: การนำเอาการลดคีโตน (KRED) มาใช้ทำให้สามารถลดการดูดซึมแบบสเตอริโอที่มีประสิทธิภาพสูงและแบบเลือกสรรของβ-ไฮดรอกซีเอสเตอร์; นอกจากนี้ เอ็นไซม์ TrpB ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมยังถูกนำมาใช้เพื่อสังเคราะห์ทริปโตเฟนที่มีฟลูออริเนต ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องมีการแก้ปัญหาไครัลอีกต่อไป เป็นผลให้จำนวนขั้นตอนการสังเคราะห์ลดลง และลดการใช้กลุ่มป้องกันให้เหลือน้อยที่สุด ดังแสดงในรูปด้านล่าง
เส้นทางสังเคราะห์สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของส่วนภาคเหนือนี้ได้ถูกนำไปใช้ในการพัฒนาทางคลินิกด้วย อย่างไรก็ตาม โอกาสที่เกิดจากกลยุทธ์เชิงโครงสร้างได้สร้างความจำเป็นในการปรับเส้นทางการสังเคราะห์ชิ้นส่วนให้เหมาะสมยิ่งขึ้น
ประการแรก การค้นพบที่สำคัญเกี่ยวกับสารตัวกลางในการตกผลึกระยะสุดท้ายสามตัวถือเป็นจุดสำคัญสำหรับการควบคุมความบริสุทธิ์ ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องปรับเปลี่ยนเส้นทางสังเคราะห์เพื่อสกัดกั้นตัวกลางทั้งสามนี้
ประการที่สอง แนะนำให้ทำปฏิกิริยาไซโคลไตรเมอไรเซชันของโอเลฟินส์ให้ช้าที่สุดในระหว่างกระบวนการสังเคราะห์ แนวทางนี้ขึ้นอยู่กับการพิจารณาว่าตัวเร่งปฏิกิริยารูทีเนียมอาจเพิ่มต้นทุนโดยรวมของการผลิตเบนโซไทอูรามีน การทำปฏิกิริยานี้ในขั้นตอนสุดท้ายของเส้นทางสังเคราะห์สามารถลดต้นทุนได้อย่างมาก
ดังนั้นสิ่งนี้จึงอำนวยความสะดวกในการเพิ่มประสิทธิภาพแนวทางรุ่นที่สาม
ระบบสเต็ปทั่วไปรุ่นที่สาม
ผ่านไฮดรอกซิเลชันของเอนไซม์ L-proline จะถูกออกซิไดซ์โดยตรงไปยัง 3-hydroxyproline ด้วยค่าสเตอริโอซีเล็กติวิตี้เกิน 99:1; มีการระบุตัวกลางที่สำคัญ เช่น ความตกผลึกของเกลือเบนซีนซัลโฟเนต ซึ่งทำให้สามารถหลีกเลี่ยงการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีได้ มีการใช้ส่วนประกอบแบบโมดูลาร์ พร้อมด้วยการปรับเปลี่ยนลำดับการควบคู่ของกรดอะมิโนและทำให้กลยุทธ์กลุ่มการป้องกันง่ายขึ้น ดังที่แสดงตัวอย่างประกอบในรูปด้านล่าง
ชิ้นส่วนสังเคราะห์ภาคเหนือรุ่นที่สาม MK-0616 แตกต่างจากชิ้นส่วนที่สังเคราะห์ในสองรุ่นก่อนหน้า การคัดเลือกนี้ขับเคลื่อนโดยการจำแนกผลึกเพนทาโนเอต 91 ซึ่งขาดตกค้างของกรดอะมิโนทรีโอนีน (ที่จะรวมไว้ในภายหลังในระหว่างการสังเคราะห์) เกลือนี้สามารถแยกได้โดยมีผลผลิตและความบริสุทธิ์สูง และให้สารตัวกลางที่มีความเสถียรสูงซึ่งสามารถจัดเก็บเป็นตัวกลางหลักได้ตลอดกระบวนการสังเคราะห์
ด้วยการเพิ่มประสิทธิภาพในรุ่นที่สาม การแยกชิ้นส่วน Northern ที่ออกแบบใหม่ (91) ต้องใช้เพียง 14 ขั้นตอนเท่านั้น—เพียงหนึ่งในสามของจำนวนขั้นตอนที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์รุ่นแรก นอกจากนี้ สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือในโปรโตคอลรุ่นที่สาม ลำดับเชิงเส้นที่ยาวที่สุดลดลงมากกว่าครึ่ง โดยลดลงจาก 20 ขั้นตอนเหลือ 9 ขั้นตอน
2.2 การเพิ่มประสิทธิภาพของส่วนภาคใต้
รุ่นแรกประกอบด้วย 15 ขั้นตอน
เริ่มต้นจากวัตถุดิบที่จัดหาในปริมาณมากจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์ กระบวนการ 9 ขั้นตอนแสดงถึงลำดับเชิงเส้นที่ยาวที่สุด ดังแสดงในรูปด้านล่าง
ระบบซิงโครนัสรุ่นที่สอง
ในการสังเคราะห์รุ่นที่สอง สิ่งที่ได้รับการปรับปรุงไม่ใช่จำนวนขั้นตอน แต่เป็นประสิทธิภาพโดยรวมและการควบคุมความบริสุทธิ์ ดังที่แสดงในโครงร่างด้านล่าง หลังจากการทดลองหลายพันครั้ง พบว่ามีการระบุชิ้นส่วน Southern blot ที่เรียกว่าเกลือลีลามีน (99)
ก่อนหน้านี้การใช้สารประกอบทั้งสองนี้ได้รับการแสดงให้เห็นว่าทำหน้าที่เป็นตัวทำละลายที่ไม่ใช่ไครัลสำหรับกรดคาร์บอกซิลิก ด้วยเหตุนี้ จึงสามารถได้รับเกลือผลึก (99) ได้อย่างน่าประหลาดใจในฐานะสารที่มีความบริสุทธิ์สูง ดังนั้นจึงหลีกเลี่ยงงาน HPLC ในการเตรียมการอย่างกว้างขวางซึ่งจำเป็นในการสังเคราะห์รุ่นก่อนหน้า
2.3 การประกอบผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย
ทั้งชิ้นส่วนทางเหนือรุ่นแรกและชิ้นส่วนตรงกลางที่สองของชิ้นส่วนทางใต้สามารถป้องกันได้ทันทีเพื่อให้ผลผลิตเป็นสารตั้งต้นเชิงเส้น 61 ดังแสดงในรูปด้านล่าง อย่างไรก็ตามผลผลิตของผลิตภัณฑ์เมทาธีซิสของไซโคลโอเลฟินนั้นต่ำมาก
โดยไม่คำนึงว่านักวิจัยประสบความสำเร็จในการใช้ลำดับอื่น ทำให้สามารถสังเคราะห์ MK-0616 ที่สามารถปรับขนาดได้เป็นครั้งแรก ดังที่แสดงในโครงการด้านล่าง
เกลืออีนัลดีไฮด์รุ่นแรกถูกสังเคราะห์ผ่านกระบวนการ 63 ขั้นตอนที่เริ่มต้นด้วยการติดตั้งโซ่ด้านข้างบนแกนโมเลกุลผ่านอะมิเดชันที่ให้ผลตอบแทนสูง ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์ด้วย SFC ในขั้นตอนเหล่านี้ ขั้นตอนที่ 28 แสดงถึงลำดับเชิงเส้นที่ยาวที่สุด
การรวมผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายรุ่นที่สองแสดงไว้ในภาพด้านล่าง
ด้วยการปรับวิถีทางให้เหมาะสมสำหรับชิ้นส่วนทั้งภาคเหนือและภาคใต้ที่กำหนดเป้าหมายไปยังผลิตภัณฑ์เป้าหมาย ทั้งสองวิธีสามารถใช้ตัวกลางผลึกแบบชิ้นส่วนแบนเพื่อก้าวไปสู่ขั้นตอนสุดท้ายของการสังเคราะห์
ปฏิกิริยาคัปปลิ้งนี้สะอาดเพียงพอที่จะดำเนินการโดยตรงไปยังขั้นตอนถัดไปโดยใช้ปฏิกิริยาที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ
โดยรวมแล้ว เส้นทางสังเคราะห์รุ่นที่สองสำหรับ MK-0616 ต้องใช้ 43 ขั้นตอน โดย 21 ขั้นตอนถือเป็นลำดับเชิงเส้นที่ยาวที่สุด ลำดับนี้จะลดทั้งจำนวนขั้นตอนทั้งหมดและความยาวของลำดับเชิงเส้นที่ยาวที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับกระบวนการรุ่นแรกลงหนึ่งในสาม
03 นวัตกรรมทางเทคโนโลยีที่สำคัญ
การวิเคราะห์กระบวนการเพิ่มประสิทธิภาพทั้งหมดเผยให้เห็นนวัตกรรมหลายประการในเทคโนโลยีที่สำคัญ เช่น:
1、เทคโนโลยีการเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพ:ความละเอียดจลน์แบบไดนามิกของ KRED; การสังเคราะห์โดยใช้เอนไซม์ TrpB ของอะนาลอกทริปโตเฟน การแนะนำกลุ่มไฮดรอกซิลโดยตรงผ่านโพรลีนไฮดรอกซีเลส ฯลฯ
2. การทำให้บริสุทธิ์โดยอาศัยการตกผลึก: ขั้นกลางหลายขั้นตอน—เช่นเมทิลซัลโฟเนตของ Northern blot แฟรกเมนต์ หรือเกลือลีลามีนของ Southern blot แฟรกเมนต์—ถูกนำมาใช้เพื่อให้เกิดการตกผลึกให้บริสุทธิ์ ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟี
3. กลยุทธ์กลุ่มปกป้องมุมฉาก: การสลับอย่างยืดหยุ่นระหว่างกลุ่มการป้องกัน เช่น Boc และ Nosyl เพื่อให้มั่นใจถึงการเลือกสรรของปฏิกิริยาหลายขั้นตอน
4. ข้อควรพิจารณาเกี่ยวกับเคมีสีเขียว: ลดการใช้ตัวเร่งปฏิกิริยาโลหะหนัก (เช่น ตัวเร่งปฏิกิริยารูทีเนียม) และเปลี่ยนปฏิกิริยา RCM ไปสู่ขั้นต่อมาเพื่อลดต้นทุนการผลิต
04 สรุปและแนวโน้ม
บทความนี้แสดงให้เห็นถึงการบูรณาการอย่างยืดหยุ่นของการเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพและการสังเคราะห์ทางเคมี ขณะเดียวกันก็เน้นย้ำถึงบทบาทสำคัญของกระบวนการตกผลึกและการนำแนวทางการออกแบบแบบแยกส่วนมาใช้ ดังนั้นจึงเป็นการจัดแสดงระเบียบวิธีอย่างเป็นระบบที่ครอบคลุมตั้งแต่การสำรวจในห้องปฏิบัติการไปจนถึงการผลิตในระดับอุตสาหกรรม งานนี้ถือเป็นกรณีตัวอย่างในด้านการสังเคราะห์โมเลกุลที่ซับซ้อน โดยจำนวนขั้นตอนทั้งหมดลดลงจาก 63 ขั้นตอนในโปรโตคอลรุ่นแรกเป็น 43 ขั้นตอนในโปรโตคอลรุ่นที่สอง โดยให้ผลตอบแทนเพิ่มขึ้นเกือบ 1,000 เท่า และทำให้มีความเป็นไปได้ในการผลิตในระดับตัน ตลอดกระบวนการทั้งหมด มีการเน้นเชิงกลยุทธ์ที่ขั้นตอนการตกผลึก ดังนั้นจึงหลีกเลี่ยงการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟี ซึ่งเป็นคุณลักษณะที่ทำให้มีความเหมาะสมอย่างยิ่งสำหรับการผลิตในระดับตัน นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังให้แม่แบบทางเทคนิคสำหรับวิธีการสังเคราะห์กับเปปไทด์แมโครไซคลิกที่ซับซ้อนอื่นๆ
