การเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพช่วยให้สามารถผลิต Macrocyclic Peptide Enlicitide ได้

สารยับยั้ง PCSK9 แบบรับประทานในการวิจัยของ MSD ซึ่งมีชื่อว่า enlicitide decanoate (MK-0616) ถือเป็นสารยับยั้ง PCSK9 เปปไทด์ชนิดรับประทานตัวแรกที่แสดงให้เห็นถึงการลด LDL-C อย่างมีนัยสำคัญในมนุษย์ Enlicitide ได้รับการพัฒนาจากหน้าจอแสดงผล mRNA ของเปปไทด์โมโนไซคลิก และต่อมาทำให้เสถียรผ่านการเชื่อมโยงข้ามที่ไม่ใช่เปปไทด์ เพื่อสร้างโครงสร้างที่ประกอบด้วยมาโครที่หลอมรวมสามตัว ออคตะเปปไทด์ที่ซับซ้อนนี้ประกอบด้วยกรดอะมิโนที่ไม่เป็นธรรมชาติ 6 ตัวและกรดอะมิโนที่เป็นโปรตีน 2 ตัวที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะเอไมด์ 12 ตัวและตัวเชื่อมโยงโซ่คาร์บอน 6 ตัวที่อยู่ตรงกลาง การสังเคราะห์ทางเคมีแบบดั้งเดิมต้องใช้ 43 ขั้นตอน ซึ่งได้แก่ การป้องกันกลุ่ม (เกือบครึ่งหนึ่งของขั้นตอนการสังเคราะห์) การทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟี และขั้นตอนเมทาธีซิสแบบปิดวงแหวนที่เร่งปฏิกิริยาด้วยรูทีเนียมที่เจือจางสูง ซึ่งจำกัดความสามารถในการขยายขนาดและความยั่งยืน

การพัฒนาการผลิตเคมีเอนไซม์

นักวิทยาศาสตร์ของ MSD ได้พัฒนากระบวนการเคมีเอนไซม์ที่กระชับและหลอมรวมเพื่อผลิต enlicitide decanoate (1) โดยการควบคู่โดยตรงของโมโนเมอร์ด้วยกรดอะมิโนไลเกส รวมกับการแยกส่วนเปปไทด์ทางชีวภาพและแมคโครไซไลเซชันโดยใช้เอสเทอเรสและอิมีนรีดักเตส

ความสำเร็จที่สำคัญ

การประกอบเรียงซ้อนของเอนไซม์สามตัวโดยใช้เอ็นเอทีพีจับ

- น้ำตกเอนไซม์สามตัว (เอ็นไซม์จับ ATP สองตัวที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม + การรีไซเคิล ATP) ประกอบเตตราเปปไทด์จากกรดอะมิโนที่ไม่มีการป้องกัน ATP-grasp ligases (โดยเฉพาะ AALs ที่ขึ้นกับกรดอะมิโนที่ขึ้นกับ ATP) เป็นเอนไซม์ที่กระตุ้นการสร้างพันธะเอไมด์ระหว่างกรดอะมิโนหรือเปปไทด์ที่ไม่มีการป้องกันโดยใช้ ATP เป็นแหล่งพลังงาน กลไกของพวกมันดำเนินการผ่านสารตัวกลางแอนไฮไดรด์ผสม ซึ่งช่วยให้สามารถเชื่อมต่อโดยตรงโดยไม่จำเป็นต้องป้องกันกลุ่มบนนิวคลีโอฟิลิกเอมีนหรือผู้ให้เอซิลที่ถูกกระตุ้น ในการศึกษานี้ นักวิจัยใช้ ATP-grasp ligase จาก Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) และตัวแปรที่ได้รับการออกแบบ (Trp-BaAALEng และ Phe-BaAALEng) เพื่อเลือกขยายไดเปปไทด์ด้วยกรดอะมิโนที่ไม่ใช่ธรรมชาติ 2 ชนิด (ทริปโตเฟนและอะนาล็อกฟีนิลอะลานีน) ในหม้อเดียว ไลเกสเหล่านี้มีกระเป๋าอิเล็กโทรฟิลที่แคบและฝังอยู่ ซึ่งรับกรดอะมิโนเดี่ยวเป็นอิเล็กโทรฟิล (ซับสเตรตที่ปลาย C) แต่สามารถรองรับเปปไทด์ที่ยาวกว่าได้เป็นนิวคลีโอไทล์ N การเลือกสรรนี้ทำให้พวกมันเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการประกอบเปปไทด์ที่ปราศจากกลุ่มการปกป้องตามลำดับตั้งแต่ปลาย C ถึงปลาย N ATP ที่ใช้ไปจะถูกรีไซเคิลโดยใช้โพลีฟอสเฟตไคเนส (FbPPKWT) โดยมีเฮกซาเมตาฟอสเฟตราคาไม่แพงเป็นผู้บริจาคฟอสเฟต

เอสเทอเรสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (RsEstEng) มาโครแลคตาไนเซชันแบบเลือกซ้ำ

- เอสเทอเรสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (RsEstEng) เร่งปฏิกิริยาแมคโครแลคทาไมเซชันแบบเลือกซ้ำเพื่อสร้างส่วนทางตอนเหนือ (ผลผลิต 73%, ขนาด 52 กก.) RsEstEng มาจากคาร์บอกซีเอสเทอเรสชนิดไวด์ (RsEst) ที่ระบุจาก Roseibacillus sp หน้าที่ดั้งเดิมของมันคือไฮโดรไลซิสของพันธะเอสเตอร์ ด้วยการวิวัฒนาการโดยตรง นักวิจัยได้เปลี่ยนมันให้กลายเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับการเกิด macrolactamization แบบ regioselective ซึ่งเป็นการก่อตัวของพันธะ macrocyclic amide ในการสังเคราะห์ชิ้นส่วนภาคเหนือ (4) ของ enlicitide โดยยอมรับเทอร์ต-บิวทิลเอสเทอร์ที่เสถียรและเทอะทะของลิเนียร์เตตราเปปไทด์ (9) เป็นผู้บริจาคอะซิลเพื่อผลิตเปปไทด์แมโครไซคลิก (4) เพื่อสร้างพันธะเอไมด์ภายในโมเลกุล โดยสามารถเกิดปฏิกิริยาไซคลิกไลเซชันแบบเลือกได้โดยไม่มีโอลิโกเมอร์ที่ตรวจพบได้และมีผลพลอยได้จากการไฮโดรไลซิสเอสเทอร์เพียง 0.8% แม้ภายใต้สภาวะความแรงของไอออนิกสูงจากน้ำตกเอนไซม์ก่อนหน้านี้

thioesterase ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (BlTEEng) การผูกระหว่างโมเลกุล

- ไทโอเอสเทอเรสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (BlTEEng) ทำการผูกระหว่างโมเลกุลของชิ้นส่วนภาคเหนือ (4) และชิ้นส่วนตะวันออก (3) โดยไม่มีการสร้างเอพิเมอไรเซชัน BlTEEng เป็นเวอร์ชันดัดแปลงของโดเมนไทโอเอสเทอเรส (TE) ซึ่งแต่เดิมถูกตัดออกจากเอ็นเพปไทด์ซินเทเตสที่ไม่ใช่ไรโบโซมอล (NRPS) ของ Brevibacillus laterosporus (BlTE) ไทโอเอสเทอเรสชนิดไวด์ในระบบ NRPS โดยทั่วไปจะกระตุ้นแมคโครไซไลเซชันหรือการปลดปล่อยเปปไทด์เชิงเส้นจากโปรตีนพาหะผ่านพันธะไทโอเอสเตอร์ แวเรียนต์ที่ถูกทำวิศวกรรมของ BlTE แสดงฤทธิ์บางอย่างแต่ชอบผลพลอยได้จากไดเมอร์ วิศวกรรมเอนไซม์ได้เปลี่ยนเอนไซม์เพื่อกระตุ้นการผูกมัดระหว่างโมเลกุลโดยใช้ไอโซโพรพิลออกซีสเตอร์ที่มีความเสถียรมากกว่า แทนที่จะเป็นไทโอเอสเทอร์ที่ไม่ละลายน้ำตามธรรมชาติ

เอนไซม์สี่ตัวเรียงซ้อนรีดักทีฟอะมิเนชั่นแมโครไซไลเซชัน

- น้ำตกสี่เอนไซม์ (PsIREDEng, KsKREDEng และเอนไซม์รีไซเคิลโคแฟคเตอร์ StLDHWT, TvADHWT) บรรลุการเกิดแมโครไซคลิกอะมิเนชั่นแบบรีดิทีฟเพื่อสร้างไดเอมีนแบบไบไซคลิก (ผลผลิต 69%, ขนาด 46 กก.) KsKREDEng เป็นคีโตเรดักเตสที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมจาก Kyrpidia sp. โดยจะเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบเบนไซลิกแอลกอฮอล์ (10) ให้เป็นอัลดีไฮด์ชั่วคราว (11) ซึ่งขึ้นอยู่กับ NAD+ PsIRED เป็นอิมีนรีดักเตสจาก Pseudogymnoascus sp. มันขึ้นอยู่กับ NADPH PsIREDEng เร่งปฏิกิริยารีดักทีฟอะมิเนชันของอัลดีไฮด์ (11) และเอมีนที่มีอยู่เพื่อสร้างไซคลิกอิมีน (12) ตามด้วยรีดักชันเป็นมาโครเอมีนทุติยภูมิ (13) StLDHWT สร้าง NAD+ ขึ้นมาใหม่สำหรับขั้นตอนออกซิเดชันโดยรีดิวซ์ไพรูเวตเป็นแลคเตต ในขณะที่ TvADHWT สร้าง NADPH ขึ้นมาใหม่สำหรับขั้นตอนรีดักทีฟโดยการออกซิไดซ์ไอโซโพรพานอลเป็นอะซิโตน

แมโครไซไลเซชันขั้นสุดท้ายผ่านทาง PBP ไทโอเอสเทอเรสที่ถูกทำวิศวกรรม

- การควบคู่ทางเคมีกับชิ้นส่วนตะวันตก (2) ตามด้วยโปรตีนไทโอเอสเทอเรสที่จับกับเพนิซิลลิน (SsPBP-TEEng) ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม ปิดมาโครไซเคิลสุดท้ายที่ความเข้มข้นสูง (70 กรัม/ลิตร) – เอาชนะข้อจำกัดการเจือจางโดยทั่วไป (5 กรัม/ลิตรในการสังเคราะห์แบบดั้งเดิม) กระบวนการโดยรวมประกอบด้วยขั้นตอนแบบเรียงซ้อนสามขั้นตอน เอนไซม์ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม 7 รายการ + เอนไซม์เสริม 3 รายการ ผลผลิตโดยรวม 39% การสาธิตในระดับหลายกิโลกรัม ความบริสุทธิ์ >99% ไม่มีโครมาโทกราฟี และไม่มีกลุ่มปกป้อง งานนี้มอบพิมพ์เขียวที่ยั่งยืนและปรับขนาดได้สำหรับการผลิตเปปไทด์แมโครไซคลิกที่ซับซ้อน ซึ่งช่วยลดจำนวนก้าวและของเสียได้อย่างมาก ขณะเดียวกันก็ปรับปรุงประสิทธิภาพและการเข้าถึงผู้ป่วย